杞枣口服液铅毒性干预作用的动物实验研究报告

北京大学儿童青少年卫生研究所

2004-6-17

工业化和城市化在给人类带来现代幸福生活的同时，也带来了一系列社会和健康问题。儿童铅中毒即是其中之一，其表现为多系统、多器官功能损伤，特别是对智能发育产生不可逆的损伤。因此，怎样有效的防治铅中毒成为目前甚为关注的课题之一。儿童铅中毒防治应着眼于环境干预、健康教育和临床治疗相结合的原则，健康教育是基本手段，环境干预是根本方法，对中度及以上铅中毒，临床治疗是重要环节，三者的有机结合是成功处理儿童铅中毒的基本保证。

浙江泰利森药业有限公司 生产的杞枣口服液具有补肾健脾、益气养血的功效，用于小儿因脾肾虚弱，气血不足所致的神疲乏力，食欲不振，面色无华，记忆力减退等症，对高血铅儿童能促进血铅的排除。为客观评价该产品是否具有拮抗铅毒性的功效，对发育期铅染毒小鼠的重要脏体比和一些特征性生化指标影响具有保护作用，特进行以下动物学实验。

本课题从动物实验的方面，就血铅水平与发育期小鼠生长发育的关系；杞枣口服液是否具有抑制铅毒性作用进行了较为系统的研究，从而观察了此口服液对铅毒性干预作用的影响。

一、实验材料

1. 主要试剂及药品

杞枣口服液 ( 国药准字 B20020312) 浙江泰利森药业有限公司

超氧化物歧化酶（ SOD ）测试盒 南京建成生物工程研究所

丙二醛（ MDA ）测试盒 南京建成生物工程研究所

还原型谷胱甘肽（ GSH ）测试盒 南京建成生物工程研究所

一氧化氮（ NO ）测试盒 南京建成生物工程研究所

维生素 C 测试盒 南京建成生物工程研究所

总蛋白定量测试盒（考马斯亮兰） 南京建成生物工程研究所

葡萄糖酸锌 北京精求化工有限责任公司

葡萄糖酸钙 北京精求化工有限责任公司

醋酸铅 北京市红星化工厂

无水乙醇 北京化工厂

2. 主要仪器

VIS-7220 型可见分光光度计 北京瑞利分析仪器公司

721- 分光光度计 上海第三分析仪器厂

离心机 北京医用离心机厂

MD100-2 分析天平 上海天平仪器厂

电热恒温水温箱 北京医疗设备厂

电热三用水箱 北京医疗设备厂

3. 实验动物

实验所用昆明种小鼠均由北京大学医学部实验动物中心提供。

二、 材料和方法

1. 动物实验

1.1 实验动物 采用刚离乳（出生 21 天）的雄性昆明小鼠 103 只，体重 20 ± 2g 。由北京大学医学部实验动物中心提供和饲养。

1.2 动物分组 本实验将动物随机分为八组，每组 12-14 只小鼠。

A 自然对照组：饮用自来水

B 铅对照组：饮用醋酸铅水 (200mg/L)

C 口服液对照组：饮用自来水 + 口服液（高剂量） (0.6ml) 灌胃

D 实验 1 组：饮用醋酸铅水 + 口服液（低剂量） (0.2ml) 灌胃

E 实验 2 组：饮用醋酸铅水 + 口服液（中剂量） (0.4ml) 灌胃

F 实验 3 组：饮用醋酸铅水 + 口服液（高剂量） (0.6ml) 灌胃

G 钙干预组：饮用醋酸铅和葡萄糖酸钙 (8968mg/L) 的水

H 锌干预组：饮用醋酸铅和葡萄糖酸锌 (128mg/L) 的水

1.3 给药途径及给药时间

每天上午 8 ： 30 喂食一次，自由进各组制备的饮用水。待处死前三天各组小鼠改喂自来水，处死前晚上给各组小鼠禁食。实验期三周，小鼠断头处死，采集一份血，测血红蛋白，分离脑、肾、肝脏组织。

1.4 动物脑、肝脏、肾脏称重

分离出脑、肾脏和肝脏组织后立即用电子秤称重，并计算脏体比。

1.5 动物血红蛋白测定

氰化高铁血红蛋白 (HICN) 法：取血 20ul 加到 5ml HICN 试剂中，充分混匀，静置 5 分钟，于分光光度计 540nm 处， 1cm 光径比色杯，以 HICN 试剂或蒸馏水为空白测吸光度，则测定管血红蛋白 (g/L) ＝测定管吸光度× 251 × 64458/44000 ＝测定管吸光度× 367.7

1.6 动物脑组织脂质过氧化产物测定

将脑组织在低温下制成脑匀浆，参照南京建成生物工程研究所提供

的试剂盒上的方法测定脂质过氧化产物丙二醛 (MDA) 。

1.7 动物脑组织超氧化物歧化酶测定

将脑组织在低温下制成脑匀浆，参照南京建成生物工程研究所提供的试剂盒上的方法测定超氧化物歧化酶 (SOD) 。

1.8 动物脑组织谷胱甘肽过氧化物酶测定

将脑组织在低温下制成脑匀浆，参照南京建成生物工程研究所提供的试剂盒上的方法测定过谷胱甘肽氧化物酶 (GSH) 。

1.9 动物脑组织一氧化氮测定

将脑组织在低温下制成脑匀浆，参照南京建成生物工程研究所提供的试剂盒上的方法测定一氧化氮 (NO) 。

2. 资料分析

检验各指标不同组之间的差异， 采用 SPSSPC 统计分析软件包 ，利用 t 检验、方差分析检验各指标间的相关关系。

三、 结果与分析

1. 小鼠脏体比

口服液灌胃对照组的脏体比与自然对照组相比差异无显著性，说明口服液未对小鼠脏体比产生不良影响。而与自然对照组相比，单纯染铅使脏体比减小，且具有显著性差异 (P<0.05) ，说明染铅对小鼠的脑、肝、肾的脏体比值产生影响，使之减少。与铅对照组相比：染铅同时给杞枣口服液组脏体比值有增加的趋势 , 而且随着口服液剂量的增加脏体比逐渐增大，说明杞枣口服液可拮抗铅的不良影响；染铅同时补充钙 (G 组 ) 和补充锌 (H 组 ) 未见显著性的脏体比变化，说明钙与锌不能拮抗铅的不良影响。各组小鼠脏体比的计算结果见表 1 及图 1 。

表 1 各组小鼠脏体比 (x ± s)

* 表示与自然对照组相比 p<0.05 ； ** 表示 P<0.01

# 表示与铅对照组相比 p<0.05 ； ## 表示 P<0.01

图 1 各组小鼠脏体比

2. 各组小鼠血红蛋白水平测定

与自然对照相比，单纯染铅使得血红蛋白含量下降，且差异具有显著性 (P<0.05) 。染铅同时给杞枣口服液组小鼠血红蛋白水平较铅组有所提高，且有随口服液剂量的增加而上升的趋势。染铅同时给予高剂量口服液、给予葡萄糖酸钙以及葡萄酸锌组小鼠其血红蛋白含量也较单纯染铅组有所提高，且差异有显著性。说明高剂量杞枣口服液以及葡萄糖酸钙和葡萄酸锌可拮抗铅所致血红蛋白降低的不良影响。各组小鼠血红蛋白情况见表 2 及图 2 。

表 2 各组小鼠血红蛋白比较 （ μ moL/g ）

(x ± s)

* 表示与自然对照组相比 p<0.05 ； ** 表示 P<0.01

# 表示与铅对照组相比 p<0.05 ； ## 表示 P<0.01

图 2 各组小鼠血红蛋白

3. 动物脑组织脂质过氧化产物测定

单纯染铅组小鼠脑皮质中 MDA 含量与自然对照相比无显著性差异，说明，此铅染毒剂量未对小鼠 MDA 含量产生明显影响。与自然对照组相比，单纯口服液组脑皮质中 MDA 含量明显下降，且具有显著性差异 (P<0.05) ，说明口服液可以降低小鼠脑皮质中固有的 MDA 含量。与单纯染铅组相比，染铅同时给低、中剂量口服液以及葡萄糖酸锌组 MDA 含量分别下降了 33.1% 、 55.2% 和 56.7% ，且差异具有显著性 (P<0.05) ，说明，低、中剂量口服液以及锌对铅毒性有一定的拮抗作用。测定脑匀浆的脂质过氧化产物丙二醛 (MDA) 含量结果见表 3 及图 3 。

表 3 各组小鼠脑组织 MDA 含量（ μ moL/gPr ）

(x ± s)

* 表示与自然对照组相比 p<0.05 ； ** 表示 P<0.01

# 表示与铅对照组相比 p<0.05 ； ## 表示 P<0.01

图 3. 各组小鼠脑匀浆 MDA 比较

4. 动物脑组织超氧化物歧化酶测定

与自然对照相比，染铅可以使超氧化物歧化酶活力下降，单纯染铅组小鼠脑皮质中 SOD 含量降低了 35.88%, 且差异具有显著性 (P<0.05) 。单纯给口服液组小鼠 SOD 含量与自然对照组相比无显著性差异，说明口服液对小鼠脑组织中超氧化物歧化酶 (SOD) 未产生不良影响。与铅对照组相比：染铅同时给予不同剂量杞枣口服液，中、高剂量口服液组分别增加了 41.29% 和 66.66% ，且差异有显著性 (P<0.05) ，说明中、高剂量口服液可以拮抗铅降低 SOD 的毒性。与单纯染铅组相比，染铅同时给葡萄糖酸钙和葡萄糖酸锌组小鼠脑皮质中 SOD 含量未见显著性增加，说明在本实验剂量下，钙和锌不能拮抗铅降低 SOD 的毒作用。测定脑组织匀浆的超氧化物歧化酶 (SOD) 含量结果见表 4 及图 4 。

表 4. 各组小鼠脑匀浆 SOD 含量 （ μ moL/gPr ）

(x ± s)

* 表示与自然对照组相比 p<0.05 ； ** 表示 P<0.01

# 表示与铅对照组相比 p<0.05 ； ## 表示 P<0.01

图 4. 各组小鼠脑匀浆 SOD 比较

5. 动物脑组织谷胱甘肽过氧化物酶测定

铅可以使过氧化物酶活性明显下降。与自然对照相比，单纯染铅组脑皮质中 GSH 含量降低了 62.22% ，差异具有显著性 (P<0.05) 。与铅对照组相比，染铅同时给杞枣口服液、葡萄糖酸钙和葡萄糖酸锌组脑皮质中 GSH 含量明显增加，且差异具有显著性 (P<0.05) ，其中低、中、高剂量组分别增加了 15.38% 、 34.61% 、 36.66% ，即随着口服液剂量的增加过氧化物酶活性逐渐增强。说明，口服液、钙和锌可拮抗铅所致的脑皮质中谷胱甘肽过氧化物酶降低的不良影响。测定脑匀浆的过氧化物酶 (GSH) 含量结果见表 5 及图 5 。

表 5 各组小鼠脑匀浆 GSH 含量（ μ moL/gPr ）

(x ± s)

* 表示与自然对照组相比 p<0.05 ； ** 表示 P<0.01

# 表示与铅对照组相比 p<0.05 ； ## 表示 P<0.01

图 5. 各组小鼠脑匀浆 GSH 比较

6. 动物脑组织一氧化氮测定

铅可以使一氧化氮含量明显增加。与自然对照相比，单纯染铅组小鼠脑皮质中 NO 含量增加了 62.76% ，差异具有显著性 (P<0.05) 。单纯给口服液组 NO 含量较自然对照组无显著性差异，可见口服液并未对小鼠脑皮质中 NO 产生不良影响。与铅对照组相比：染铅同时给杞枣口服液、葡萄糖酸钙以及葡萄糖酸锌组脑皮质中 NO 含量均明显降低，而且随着口服液剂量的增加 NO 含量逐渐降低，说明，口服液、钙以及锌可以拮抗铅对脑皮质中 NO 含量增加的不良影响。脑组织匀浆的一氧化氮含量结果见表 6 及图 6 。

表 6 各组小鼠脑匀浆 NO 含量 ( μ moL/gPr )(x ± s)

* 表示与自然对照组相比 p<0.05 ； ** 表示 P<0.01

# 表示与铅对照组相比 p<0.05 ； ## 表示 P<0.01

图 6 各组小鼠脑匀浆 NO 比较

四、 讨论

很多研究表明，脑、肾、肝脏对铅的吸收较其他组织明显。脑组织是铅的重要靶器官，全脑总体含铅量约为 0.2mg/kg, 肝脏含铅量约为 0.5mg/kg ，肾脏约为 0.8 mg/kg 。脏体比能很好地反应铅对小鼠重要脏体的影响， 本实验观察了不同组别小鼠的脏体比变化。 结果表明，口服液灌胃对照组的肝体比与自然对照组相比差异无显著性，说明口服液未对小鼠脏体比产生不良影响。而与自然对照组相比，单纯染铅使脏体比减小，且具有显著性差异 (P<0.05) ，说明染铅对小鼠的脑、肝、肾的脏体比值产生影响，使之减少。与铅对照组相比，染铅同时给杞枣口服液组脏体比值有增加的趋势 , 而且随着口服液剂量的增加脏体比逐渐增大，说明杞枣口服液可拮抗铅的不良影响。染铅同时补充钙和补充锌未见显著性的脏体比变化，说明钙与锌不能拮抗铅对动物脏体比的不良影响。

血红素和珠蛋白结合形成血红蛋白。铅中毒时由于血红素合成受阻，使血红蛋白水平下降引起贫血。本实验中，单纯染铅使得血红蛋白含量较自然对照组下降，且差异具有显著性。染铅同时给杞枣口服液组小鼠血红蛋白水平较铅组有所提高，且有随口服液剂量的增加而有上升的趋势。染铅同时给予高剂量口服液、给予葡萄糖酸钙以及葡萄酸锌组小鼠其血红蛋白含量也较单纯染铅组有所提高，且差异有显著性。说明高剂量杞枣口服液以及葡萄糖酸钙和葡萄酸锌可拮抗铅所致血红蛋白降低的不良影响。铅中毒与贫血的因果关系十分肯定，尽管有个别研究未能证实血铅水平和血红蛋白水平间的负相关关系，但有学者认为这是血红蛋白对血铅增高的反应不够特异、不够灵敏的缘故。

近年来研究发现，生物膜对铅离子的毒作用很敏感，神经细胞膜是铅离子的厨师作用部位 [37] 。文献报道脂质过氧化产物 MDA 可以交联蛋白质及磷脂的氨基，生成 Schiff 碱，影响膜的流动性、交联、结构和功能，是膜脆性增加，从而造成膜的损伤。铅具有增强脂质过氧化的效应，可使神经细胞膜受到损伤。本实验测定了小鼠脑组织脂质过氧化产物 MDA 的含量。 结果显示， 单纯染铅组小鼠脑皮质中 MDA 含量与自然对照相比无显著性差异，说明，此铅染毒剂量未对小鼠 MDA 含量产生明显影响。与自然对照组相比，单纯口服液组脑皮质中 MDA 含量明显下降，且具有显著性差异，说明口服液可以降低小鼠脑皮质中固有的 MDA 含量。与单纯染铅组相比，染铅同时给低、中剂量口服液以及葡萄糖酸锌组 MDA 含量均下降，且差异具有显著性，说明，低、中剂量口服液以及锌对铅毒性有一定的拮抗作用。

超氧化物歧化酶是一类金属酶 , 广泛存在于生物体内。 SOD 对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，此酶能清除超氧阴离子自由基保护细胞免受损伤。 本实验测定了小鼠超氧化物歧化酶 SOD 的含量。结果显示，铅可以使超氧化物歧化酶活力下降。 与自然对照组相比，染铅可以使超氧化物歧化酶活力下降，且差异具有显著性。单纯给口服液组小鼠 SOD 含量与自然对照组相比无显著性差异，说明口服液对小鼠脑组织中超氧化物歧化酶 SOD 未产生不良影响。与铅对照组相比：染铅同时给予不同剂量杞枣口服液小鼠脑皮质中 SOD 含量有明显增加的趋势，说明口服液可以拮抗铅降低 SOD 的毒性。染铅同时给葡萄糖酸锌组、葡萄糖酸钙组与单纯染铅对照组相比小鼠脑皮质中 SOD 含量未见显著性增加，说明，钙和锌不能拮抗铅降低 SOD 的毒性作用。谷胱甘肽过氧化物酶是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解的酶，它特异的催化还原型谷胱甘肽 (GSH) 对氢过氧化物的还原反应，一般认为它在细胞内能清除有害的过氧化物代谢产物，阻断脂质过氧化链锁反应，从而起到保护细胞膜结构和功能完整的作用。 本实验还原型谷胱甘肽的测得结果显示，铅可以使过氧化物酶活性明显下降。与自然对照相比，单纯染铅脑皮质中 GSH 含量下降。与铅对照组相比，染铅同时杞枣口服液灌胃组脑皮质中 GSH 含量明显增加，而且随着口服液剂量的增加 GSH 活性也逐渐增强。自由饮用铅和钙水组以及自由饮用铅和锌水组脑皮质中 GSH 含量也较铅对照组有明显增加的趋势。 说明，口服液、钙和锌可拮抗铅所致的脑皮质中谷胱甘肽过氧化物酶降低的不良影响。

一氧化氮 (NO) 是近年来生命科学研究中最热点课题之一，与临床心血管系统、神经、胃肠、泌尿、免疫系统、肾病、肝病、糖尿病、肿瘤、创伤、感染、器官移植排斥反应和男性性功能调控等都有密切关系。 NO 是一种新的免疫分子和炎症介质、介导内毒素、 TNF 、 IL-6 等细胞因子的病理作用。本实验结果显示， 铅可以使一氧化氮含量明显增加。与自然对照相比，单纯染铅组小鼠脑皮质中 NO 含量明显增加，且差异具有显著性。单纯给口服液组 NO 含量较自然对照组无显著性差异，可见口服液并未对小鼠脑皮质中 NO 产生不良影响。与铅对照组相比：染铅同时给杞枣口服液、葡萄糖酸钙以及葡萄糖酸锌组脑皮质中 NO 含量均明显降低，而且随着口服液剂量的增加 NO 含量逐渐降低，说明，口服液、钙以及锌可以拮抗铅对脑皮质中 NO 含量增加的不良影响。

五、小结

无论是钙、锌，还是口服液对铅的干预作用主要受两个主要因素的影响，一是染铅的剂量，剂量越高干预难度越大；二是干预药物的剂量。在保证药物对机体无毒副作用，与铅毒性也无协同作用的条件下，药物剂量增加干预效果较好。本实验得出以下结论 ：

1. 实验证明，杞枣口服液可有效拮抗铅毒性，对发育期铅染毒小鼠的脏体比、血红蛋白、 MDA 、 SOD 、 GSH 、 NO 等影响指标具有保护作用。钙、锌（明确的铅拮抗剂）也具有一定的拮抗铅毒性作用，对 GSH 的影响优于口服液，但在重要的小鼠脏体比和 SOD 二项指标中未能证明其有效。

2. 本实验条件下，未见高剂量单纯口服液对发育期小鼠的脏体比、血红蛋白和 MDA 、 SOD 、 GSH 、 NO 等各项生化指标有不良影响。

3. 口服液的剂量不同所表现的拮抗作用程度也不同，口服液高剂量组干预效果较好（ MDA 指标除外）。

4. 本实验条件所给予的铅剂量可使小鼠血铅显著增高，铅中毒动物模型已经建立。此基础上的药物干预实验是有效的，数据是可靠的。

5. 所得结果是在本实验所设计的的实验条件下获得的，不得盲目外推。

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